目的：穿梭實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)比較不同缺血再灌注時間對短暫性大腦中動脈閉塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）大鼠的運(yùn)動及認(rèn)知功能的影響。

方法：取穿梭箱主動回避率超過70%的大鼠60 只隨機(jī)分為4 組：根據(jù)Bederson 評分及存活率缺血再灌注60min 組（n=8）、90min組（n=11）、120min組（n=7）及假手術(shù)組（n=7）納入*終行為學(xué)研究。術(shù)后28 天行TTC染色計(jì)算梗死體積。于術(shù)后第1、3、7、14、21、28 天進(jìn)行改良神經(jīng)功能缺損程度（mNSS）評分，第3、7、14、21、28 天進(jìn)行前肢抓握力測試；于術(shù)后第14、21、28天進(jìn)行穿梭箱測試。

結(jié)果：缺血再灌注時間越長，大鼠的生存率越低（χ2=12.694，P=0.005）；梗死體積隨缺血再灌注時間增加而增大（F=14.056，P=0.01）。缺血時間越長，mNSS評分越高（F=9.100，P=0.001）；梗死組較假手術(shù)組抓握力量減?。?/span>F=11.630，P＜0.05）；穿梭箱實(shí)驗(yàn)顯示各時間點(diǎn)90min組主動回避率較假手術(shù)組降低（P＜0.05），120min組第14、21 天時較假手術(shù)組主動回避率降低（P＜0.05）。

結(jié)論：tMCAO大鼠隨缺血再灌注時間延長，運(yùn)動功能障礙嚴(yán)重程度增加，缺血60min 再灌注不出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，且因運(yùn)動功能自發(fā)性恢復(fù)速度快，不適用于認(rèn)知功能及長期運(yùn)動功能行為學(xué)測試。缺血90min、120min出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙。

關(guān)鍵詞 ： 短暫性大腦中動脈閉塞；缺血再灌注；運(yùn)動；認(rèn)知

我國每年有新發(fā)腦卒中患者約200 萬人，腦卒中已成為我國的主要致殘病因[1]，腦卒中后常見的問題包括運(yùn)動、吞咽、言語、認(rèn)知功能障礙等。卒中后認(rèn)知功能障礙（post stroke cognitive impairment,PSCI）的發(fā)病率高達(dá)64%且長期存在[2]，嚴(yán)重影響其他功能的康復(fù)，因而對認(rèn)知障礙的研究尤為重要。目前腦卒中相關(guān)動物模型有多種，但大多數(shù)是針對運(yùn)動功能障礙，而認(rèn)知功能障礙動物模型較少。短暫性大腦中動脈閉塞（transient middle cerebralartery occlusion, tMCAO）能很好地模仿人類因血管閉塞引起的腦梗死這一**發(fā)病模式，常被用于認(rèn)知功能相關(guān)研究，但tMCAO模型是否會出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙仍有一定爭議，且各實(shí)驗(yàn)室對缺血再灌注時間的選擇不一，具有一定隨意性，常見的缺血時間為120min、90min、60min[4]，不同缺血再灌注時間對tMCAO大鼠的運(yùn)動及認(rèn)知的影響有何區(qū)別，少有研究涉及。本研究就不同缺血再灌注時間對大鼠的運(yùn)動及認(rèn)知功能的影響進(jìn)行研究，為今后tMCAO模型相關(guān)實(shí)驗(yàn)的缺血再灌注時間選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SPF 級雄性SD 大鼠60 只，體重235—255g，由廣東中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SCXK（粵）2013-0034，所有動物均飼養(yǎng)于中山大學(xué)（生命科學(xué)學(xué)院中藥與海洋**實(shí)驗(yàn)室）SPF 級實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，許可證號：SYXK（粵）2014-0020，采用已**顆粒型大鼠飼料喂養(yǎng)，飲用****水，環(huán)境溫度控制在20—25℃。

1.1.2 主要儀器與試劑：YLS-13A大小鼠抓力測試儀（上海嘉適科學(xué)儀器有限公司），XR-XC105 型（上海欣軟信息科技有限公司）穿梭實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（Shuttlebox system），4—0 硅膠包被線栓（直徑0.37±0.02mm）（深圳瑞沃德生命科技有限公司），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美國Sigma）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 穿梭箱實(shí)驗(yàn)：采用XR-XC105 型穿梭實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，穿梭箱內(nèi)部（226×213×350）mm，底部設(shè)不銹鋼柵欄，使用電流作為非條件刺激，電擊動物足底部。頂部設(shè)噪聲發(fā)生器（聲音）及兩側(cè)各有一光源作為條件刺激。適應(yīng)5min 消除探究反射后予光聲刺激5s，繼予電擊10s，間隔10s 后進(jìn)入下一輪。

若在**刺激5s 內(nèi)大鼠逃向**區(qū)，則為主動回避反應(yīng)，系統(tǒng)自動停止當(dāng)次訓(xùn)練；如果在**刺激5s內(nèi)大鼠未逃向**區(qū)，則給予0.5mA 交流電刺激10s，在電擊后逃向**區(qū)為被動回避反應(yīng)陽性，否則為無反應(yīng)。每只大鼠測試20 次，系統(tǒng)自動記錄主動回避反應(yīng)次數(shù)（active avoidance response,AAR）、被動回避反應(yīng)次數(shù)（positive avoidance response,PAR）、總回避反應(yīng)（general avoidance response,GAR）為AAR+PAR，AAR與總測試次數(shù)的比值為主動回避率（active avoidance responserate, AARR）。SD大鼠預(yù)訓(xùn)練5 天，每天20 次，選擇*后2 天主動回避率超過70%的進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，并于術(shù)后14、21、28 天測試，以AARR為檢測指標(biāo)，反映大鼠的學(xué)習(xí)記記憶能力及執(zhí)行決策能力。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動物模型制作：將預(yù)訓(xùn)練達(dá)標(biāo)的SD 大鼠，予以10%的水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉，局部**備皮，頸部正中切口2—2.5cm，分離頸總動脈（CCA），預(yù)置縫線備用，沿左側(cè)CCA 分離頸外（ECA）、頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎并游離ECA 及CCA近心端。微血管夾夾閉CCA 遠(yuǎn)心端，于CCA 兩端之間處剪一小口，將制備好的直徑為0.375mm尼龍線沿切口輕輕插入，松開微血管夾并將尼龍線輕輕插入ICA，直到稍感阻力，若尼龍線插入深度為10mm，則考慮線栓插入翼顎窩，往后退一點(diǎn)，稍提起ECA，使之成直線，再往里插線栓，直到再次感覺到阻力，結(jié)扎CCA遠(yuǎn)心端，將尼龍線外留1cm 以備拔線栓時使用，根據(jù)分組不同隨機(jī)分為線栓插入60min、90min、120min 后拔出。假手術(shù)組大鼠麻醉同上，但只暴露、分離結(jié)扎血管，而不插線栓。

1.2.3 模型評價：采用改良的Bederson 評分方法進(jìn)行神經(jīng)功能評分：0 分：無神經(jīng)功能缺失體征；1 分：提尾時損傷對側(cè)前肢屈曲；2 分：前肢屈曲及對側(cè)抵抗力下降；3 分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4 分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及意識障礙；5 分：死亡。神經(jīng)功能評分1—3 分的大鼠納入本研究，*終60min 組8 只，90min 組11 只，120min組7只，假手術(shù)組7只納入研究。

1.2.4 改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分（modified neurologicalseverity scores, mNSS）[7]：該評分包括運(yùn)動功能、感覺功能和反射缺失3 大項(xiàng)，共計(jì)18 小項(xiàng)。未能完成該項(xiàng)檢查或反射缺失計(jì)1 分。10—18 分為嚴(yán)重?fù)p傷，5—9 分為中度損傷，1—4 分為輕度損傷，于術(shù)后第1、3、7、14、21、28天進(jìn)行評分。

1.2.5 抓握力測試：采用YLS-13A大小鼠抓力測定儀測試大鼠的抓力，將大鼠放置在抓力板上，抓住鼠尾輕輕向后牽拉，待大鼠抓牢抓力板后，均勻用力后拉，致使動物松爪，儀器自動記錄大鼠的*大抓力，將儀器與PC機(jī)聯(lián)機(jī)讀取數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。評價右側(cè)癱瘓前肢抓力的強(qiáng)度時，要用膠帶包裹左側(cè)未癱瘓前肢。每次測試抓力5 次，取平均值，于術(shù)后第3、7、14、21、28天進(jìn)行測試。

1.2.6 TTC 染色：于第28 天取大鼠水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉固定，開胸暴露心臟，從心尖處插入導(dǎo)管，先快后慢灌注生理鹽水200ml，置于-80℃冰箱5min，再于腦槽中取冠狀面均勻切成2mm厚腦片，取5 片放入2%的TTC 溶液（37℃）避光中染色20min，4%甲醛緩沖液固定。24h 后用相機(jī)拍照，其中粉紅區(qū)為正常腦組織，白**為梗死區(qū)（見圖2）。采用Image-Pro Plus 6軟件計(jì)算梗死體積分?jǐn)?shù)，計(jì)算公式為梗死體積/（梗死體積+未梗死體積）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，mNSS、抓握力量結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，穿梭箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。mNSS、抓握力量、穿梭箱實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差檢驗(yàn)，若有交互效應(yīng)，各時間點(diǎn)進(jìn)行單因素方差分析，各時間點(diǎn)各組之間用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩組間比較，腦梗死體積采用單因素方差分析，各組之間用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩組間比較，各組生存率采用log-rank檢驗(yàn)分析比較。

2 結(jié)果

2.1 生存率比較

實(shí)驗(yàn)大鼠隨缺血再灌注時間的延長，生存率降低（χ2=12.694，P=0.005），見圖1。死亡主要集中在造模后的前7 天，死亡原因包括蛛網(wǎng)膜下腔出血、癲癇、進(jìn)食障礙等。因死亡、Bederson 評分不達(dá)標(biāo)*終每組入組大鼠數(shù)量不同。

2.2 梗死體積的比較

實(shí)驗(yàn)組大鼠隨缺血再灌注時間延長，梗死體積變大（F=14.056，P=0.01），90min、120min 組與60min組比較有顯著性差異（P＜0.05），90min、120min 組多為皮質(zhì)及皮質(zhì)下梗死，而60min 組多為皮質(zhì)下基底核區(qū)梗死。

2.3 改良神經(jīng)功能缺損程度評分結(jié)果

缺血再灌注各組均有不同程度的運(yùn)動、感覺功能障礙，缺血時間越長，mNSS評分越高（F=9.10，P=0.001），各組隨觀察時間的延長，運(yùn)動、感覺功能逐漸改善（F=187.87，P＜0.01），前7 天恢復(fù)*快，后恢復(fù)速度減緩（見表1，圖3）。

2.4 缺血再灌注時間對大鼠患側(cè)前肢抓握力量的影響造模后缺血再灌注各組患側(cè)前肢抓握力均有不同程度降低（F=11.630，P＜0.01），隨時間緩慢恢復(fù)（F=120.780，P＜0.01），缺血時間越長，恢復(fù)所需要的時間越長，60min 組在第7 天即恢復(fù)正常，與假手術(shù)組比較差異無顯著性意義（P＞0.05），90min 組第28天與假手術(shù)組比較差異無顯著性意義。

2.5 穿梭箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果

重復(fù)測量方差分析各組之間比較（F=3.516，P＜0.05），無時間、交互效應(yīng)（P＞0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，與假手術(shù)組相比，90min 組主動回避率在各時間點(diǎn)都有明顯降低（P＜0.05），而120min 組也較假手術(shù)組有降低，在第14、21 天時差異有顯著性意義（P＜0.05），第28 天時差異無顯著性意義（P=0.052），60min組在各時間點(diǎn)與假手術(shù)組無顯著性差異（P＞0.05），見圖5。

3 討論

大鼠MCAO模型問世已經(jīng)超過三十年，應(yīng)用越來越廣泛。線栓法大腦中動脈梗死模型因其與人類因血管閉塞引起的腦梗死發(fā)病模式*類似、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來神經(jīng)實(shí)驗(yàn)*常用的模型之一，在腦梗死后神經(jīng)保護(hù)研究中有超過40%采用了線栓法大腦中動脈梗死模型，而不同的缺血再灌注時間對于運(yùn)動、認(rèn)知功能的影響有何區(qū)別尚不清楚。本研究采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)對不同缺血再灌注時間tMCAO 大鼠的運(yùn)動、感覺、認(rèn)知功能進(jìn)行了4 周的檢測，為今后tMCAO大鼠相關(guān)行為學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)，特別是認(rèn)知功能行為學(xué)檢測選擇缺血再灌注時間及檢

測時間提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn)tMCAO大鼠的缺血再灌注時間越長，mNSS 評分越高，患側(cè)前肢的抓握力量越差，提示tMCAO 大鼠運(yùn)動、感覺功能損傷程度受缺血再灌注的時間的影響，與既往研究一致，梗死大鼠運(yùn)動功能術(shù)后1 周內(nèi)改善的速度較快，隨后速度逐漸減慢，與人類卒中的恢復(fù)類似，且缺血再灌注時間越長所需要恢復(fù)到正常水平的時間越長。60min 組在1周后運(yùn)動功能改善接近于假手術(shù)組，可能的原因是缺血時間短，損傷程度輕，其次可能是缺血60min 后再灌注大部分是皮質(zhì)下基底核區(qū)梗死，而皮質(zhì)下梗死的恢復(fù)速度也更快，因而60min缺血再灌注時間不適用于對大鼠長期運(yùn)動功能相關(guān)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。

人類腦梗死3 個月后有62.6%出現(xiàn)血管性認(rèn)知功能障礙，而大鼠的MCAO模型是否會出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙及其可能的機(jī)制仍然未明確。有研究認(rèn)為MCAO模型僅會有運(yùn)動功能障礙而不會出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，多數(shù)研究顯示MCAO模型大鼠存在認(rèn)知功能障礙[13—14]，亦有分析認(rèn)為，運(yùn)動功能障礙影響了大鼠在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)，從而出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的假陽性結(jié)果[15]。記憶在認(rèn)知功能中有著舉足輕重的作用，一般認(rèn)為與記憶密切相關(guān)的海馬主要由大腦后動脈供血，理論上MCAO不會造成海馬的損傷，但實(shí)際研究發(fā)現(xiàn)，線栓法MCAO會在一定程度上減少海馬的血流量，造成一定的損傷。此外由于梗死后顱內(nèi)壓增高、水腫、炎癥等原因海馬神經(jīng)元會發(fā)生遲發(fā)性死亡，且隨時間的進(jìn)展，神經(jīng)元死亡的數(shù)量增加，這也在某種程度上解釋了為什么認(rèn)知功能障礙出現(xiàn)的較晚，且進(jìn)展性加重。也有研究認(rèn)為[18]，tMCAO模型海馬γ-氨基丁酸抑制性神經(jīng)元的上升，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶激活的下調(diào)，導(dǎo)致長時程增強(qiáng)受到抑制，因而出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙并呈進(jìn)展性。某些皮質(zhì)損傷，如新皮質(zhì)、額葉皮質(zhì)，也是認(rèn)知功能障礙出現(xiàn)的原因。部分由梗死灶單獨(dú)解釋不了的認(rèn)知功能障礙，可能是因?yàn)殡p側(cè)大腦的N-甲基-D-天冬氨酸受體的長期的下調(diào)和內(nèi)吞所導(dǎo)致的。

既往對MCAO大鼠認(rèn)知功能研究多采用水迷宮檢測大鼠的空間記憶能力，但對大鼠的運(yùn)動功能及體能要求較高，且浸入水中可能引起***或其他應(yīng)激效應(yīng)，與腦損害或藥理學(xué)操作間的相互作用具有不確定性，而穿梭箱實(shí)驗(yàn)主要研究大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及執(zhí)行決策能力，相比水迷宮對大鼠的運(yùn)動功能要求相對較小，抗外界環(huán)境干擾能力強(qiáng)。本研究顯示缺血90min、120min 后再灌注的大鼠的穿梭箱主動回避率降低，提示大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)認(rèn)知功能的損害，但并沒出現(xiàn)明顯的認(rèn)知功能進(jìn)行性下降，與既往研究不完全一致。出現(xiàn)這種差異的原因可能是認(rèn)知功能評定的方法和時間不同，上述研究中采用Morris 水迷宮測試，本研究使用穿梭箱實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行了強(qiáng)化性預(yù)訓(xùn)練，檢測時間僅為4 周，且為重復(fù)測量設(shè)計(jì)，而研究顯示重復(fù)測量能改善tMCAO大鼠功能障礙。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠tMCAO 后死亡主要集中在術(shù)后1 周，死亡原因有多種，包括蛛網(wǎng)膜下腔出血、窒息、癲癇、腸脹氣等，但*重要的原因是術(shù)后大鼠運(yùn)動功能差，無法正常進(jìn)食，進(jìn)而體質(zhì)下降，*終死亡。本研究也證實(shí)運(yùn)動功能差的120min 組生存率明顯低于60min 組，因而為了降低死亡率，術(shù)后的食物選擇、進(jìn)食方式及護(hù)理顯得尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠的梗死體積對缺血再灌注時間敏感，缺血時間長梗死體積大，與本研究結(jié)果一致。研究認(rèn)為，梗死體積與早期的行為學(xué)有相關(guān)關(guān)系，而與晚期的行為學(xué)表現(xiàn)不相關(guān)，可能原因是梗死大鼠對側(cè)大腦半球會產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，發(fā)出運(yùn)動感覺纖維跨越中線，從而出現(xiàn)運(yùn)動感覺功能自發(fā)性恢復(fù)。

本研究就不同缺血再灌注時間進(jìn)行研究，通過多種行為學(xué)方法對tMCAO 大鼠的運(yùn)動、感覺及認(rèn)知功能進(jìn)行綜合評價，認(rèn)為缺血60min 再灌注不出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，且運(yùn)動功能自發(fā)性恢復(fù)的速度快，因而不適用于認(rèn)知功能相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究及長期運(yùn)動功能相關(guān)的行為學(xué)檢測。缺血90min、120min 再灌注組出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，適用于認(rèn)知功能相關(guān)研究，但為*大程度地排除運(yùn)動功能障礙帶來干擾，認(rèn)知功能相關(guān)行為學(xué)檢測*好安排在術(shù)后較長的時間范圍（28 天），運(yùn)動功能恢復(fù)到一定程度。值得一提的是，缺血再灌注時間并不是MCAO模型**影響因素，動物種屬、線栓的類型及插入深度等都是tMCAO模型成功的關(guān)鍵，相關(guān)因素的問題有待進(jìn)一步的研究。